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水产品中硝基呋喃的测定
发布时间:2020-11-02 12:59 | 信息来源:扑克王APP

  水产品中硝基呋喃的测定_水产渔业_农林牧渔_专业资料。XXX 实验室检测中心 管理体系文件 作业指导书 (第 A 版 第 0 次修改) 文件编号: 编写: 审核: 批准: 批准日期: 受控状态:□ 受控 正副版本:□ 正本 持有者: □ 非受

  XXX 实验室检测中心 管理体系文件 作业指导书 (第 A 版 第 0 次修改) 文件编号: 编写: 审核: 批准: 批准日期: 受控状态:□ 受控 正副版本:□ 正本 持有者: □ 非受控 □ 副本 发布日期: 实施日期: 作业指导书 文件编号: 第1页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 1. 目的 使硝基呋喃的测定处于受控状态,保证硝基呋喃检测结果的准确性与一致性;规范参加本项 目检测工作人员的操作规程。 2. 适用范围 适用于水产品中硝基呋喃的测定。 3. 引用标准 《动物组织中硝基呋喃类代谢物残留的测定 酶联免疫吸附法》 SB/T 10927-2012 《出口动物源食品中硝基呋喃代谢物残留量的测定 酶联免疫吸附法》 SNT 3380-2012 《无公害食品 水发水产品》 NY 5172-2002 《分析实验室用水规格和试验方法》GB/T 6682-2008 《食品卫生检验方法 理化部分 总则》 GB/T5009.1-2003 4. 概述 硝基呋喃类(Nitrofurans)药物是一种广谱抗生素,因价格较低且效果好,而广泛用于畜 禽及水产养殖业,以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疖疮、赤鳍病、溃疡病等。但由 于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用,1995 年起欧盟禁止硝基呋喃类药物 在畜禽及水产动物食品中使用, 并严格执行对水产中硝基呋喃的残留检测,2002 年美国亦随之制 定相应法规。 5. 原理 本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应,整个方法包括四种硝基呋喃代谢物残留量的检 测。在酶标板微孔条上预包被偶联抗原,样本中的硝基呋喃代谢物残留物经衍生化后和微孔条上 预包被的偶联抗原竞争相应的抗硝基呋喃代谢物的衍生物抗体,加入酶标二抗后,用 TMB 底物显 色,样本吸光值与其所含硝基呋喃代谢物残留物的含量成负相关,与标准曲线比较再乘以其对应 稀释倍数即可得出样本中硝基呋喃代谢物残留物的残留量。 6. 试剂和材料 除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为去离子水。 6.1. 乙酸乙酯。 6.2. 正己烷。 6.3. 1N 盐酸溶液。 6.4. 1N 氢氧化钠溶液。 6.5. 呋喃唑酮(AOZ)酶联免疫检测试剂盒 作业指导书 文件编号: 第2页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 6.6. 呋喃它酮(AMOZ)酶联免疫检测试剂盒 6.7. 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测试剂盒 6.8. 呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测试剂盒 7. 仪器和设备 7.1. 微孔板酶标仪:波长 450nm/630nm。 均质器。 7.2. 氮气吹干装置。 7.3. 振荡器。 7.4. 离心机:转速 4000 r/min 以上。 7.5. 刻度移液管。 7.6. 天平:感量 0.01g。 7.7. 微量移液器:单道 20μ L~200μ L,100μ L~1000μ L、多道 250μ L。 7.8. 洗板机。 8. 呋喃唑酮(AOZ)酶联免疫检测 8.1. 样本处理 8.1.1. 取 1 g 已均质样品置入离心管中,加入 4mL H2O,0.5mL 1 M HCl,100μ L 衍生试剂。 8.1.2. 振荡混合约 1 分钟。 8.1.3. 置 60℃烘箱,静置 3h。 8.1.4. 加入 5 mL1×浓缩缓冲液,0.4mL 1M NaOH,5mL 乙酸乙酯。 8.1.5. 振荡混合约 1 分钟。 8.1.6. 以离心机离心 10 分钟(3000 rpm) 。 8.1.7. 取 2mL 上层液(乙酸乙酯层)至 10mL 玻璃试管。 8.1.8. 于 50℃下,利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。 8.1.9. 在此玻璃试管中加入 1mL 正己烷,先将残余物完全溶解(若未能完全溶解,可能会导致回 收率降低) ,再加入 1.6mL1×萃取/清洗液。 8.1.10. 振荡混合约 1 分钟。 8.1.11. 用离心机离心 10 分钟(3000 rpm) (若不分层则振荡混合后于沸水加热 3 分钟再离心一 次) 。 8.1.12. 取出下层液(水层)准备进行测试(一个检测需 0.05mL)。 稀释倍数: 4 8.2. 酶联免疫测定 使用前将试剂盒置于室温 (20-25℃) 平衡 30min 以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中, 将不用的微孔条放入自封袋, 保存于 2-8℃不要冷冻; 8.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入 50μ L 标准溶液。 8.2.2. 在其他的微孔加入 50μ L 已完成前处理的样品溶液。 作业指导书 文件编号: 第3页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 8.2.3. 再于每一微孔另加入 100μ L 已完全回温的酶标记物。 8.2.4. 轻敲酶标板四周,使其充分混合后于室温下避光静置 30 分钟。 8.2.5. 将微孔中的反应液甩掉,再将清洗液加满每一微孔后甩掉,重复 3 次。 8.2.6. 最后一次甩掉后,在吸水纸上拍干。 8.2.7. 于每一微孔加入显色液 100μ L 后,轻敲酶标板四周,使其充分混合。 8.2.8. 于室温下避光静置 20 分钟。 8.2.9. 加入反应终止液,每一微孔加入 100μ L。 8.2.10. 酶标仪以单波长 450nm 或双波长 450nm/650nm 读值。 9. 呋喃它酮(AMOZ)酶联免疫检测 9.1. 样本处理 9.1.1. 取 1 g 已均质样品置入离心管中,加入 4mL H2O,0.5mL 1 M HCl,100μ L 衍生试剂。 9.1.2. 振荡混合约 1 分钟。置 60℃烘箱,静置 3h。 9.1.3. 加入 5 mL1×浓缩缓冲液,0.4mL 1M NaOH,5mL 乙酸乙酯。 9.1.4. 振荡混合约 1 分钟。 9.1.5. 以离心机离心 10 分钟(3000 rpm) 。 9.1.6. 取 2mL 上层液(乙酸乙酯层)至 10 ml 玻璃试管。 9.1.7. 于 50℃下,利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。 9.1.8. 在此玻璃试管中加入 0.8mL 正己烷,先将残余物完全溶解(若未能完全溶解,可能会导致 回收率降低) ,再加入 0.8mL1×萃取/清洗液。 9.1.9. 振荡混合约 1 分钟。 9.1.10. 用离心机离心 10 分钟(3000 rpm) (若不分层则振荡混合后于沸水加热 3 分钟再离心一 次) 。 9.1.11. 取出下层液(水层)准备进行测试(一个检测需 0.05mL)。 稀释倍数: 2 9.2. 酶联免疫测定 使用前将试剂盒置于室温 (20-25℃) 平衡 30min 以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中, 将不用的微孔条放入自封袋, 保存于 2-8℃不要冷冻; 9.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入 50μ L 标准溶液。 9.2.2. 在其他的微孔加入 50μ L 已完成前处理的样品溶液。 9.2.3. 再于每一微孔另加入 500μ L 已完全回温的酶标记物。 9.2.4. 轻敲酶标板四周,使其充分混合后于室温下避光静置 30 分钟。 9.2.5. 将微孔中的反应液甩掉,再将清洗液加满每一微孔后甩掉,重复 3 次。 9.2.6. 最后一次甩掉后,在吸水纸上拍干。 9.2.7. 于每一微孔加入显色液 100μ L 后,轻敲酶标板四周,使其充分混合。 9.2.8. 于室温下避光静置 20 分钟。 9.2.9. 加入反应终止液,每一微孔加入 100μ L。 作业指导书 文件编号: 第4页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 9.2.10. 酶标仪以单波长 450nm 或双波长 450nm/650nm 读值。 10. 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测 10.1. 样本处理 10.1.1. 取 1 g 已均质样品置入离心管中,加入 4mL H2O,0.5mL 1 M HCl,100μ L 衍生试剂。 10.1.2. 振荡混合约 1 分钟。 10.1.3. 置 60℃烘箱,静置 3h。 10.1.4. 加入 5 mL1×浓缩缓冲液,0.4mL 1M NaOH,5mL 乙酸乙酯。 10.1.5. 振荡混合约 1 分钟。 10.1.6. 以离心机离心 10 分钟(3000 rpm) 。 10.1.7. 取 2mL 上层液(乙酸乙酯层)至 10 ml 玻璃试管。 10.1.8. 于 50℃下,利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。 10.1.9. 在此玻璃试管中加入 1mL 正己烷,先将残余物完全溶解(若未能完全溶解,可能会导致 回收率降低) ,再加入 1.6 mL1×萃取/清洗液。 10.1.10. 振荡混合约 1 分钟。 10.1.11. 用离心机离心 10 分钟(3000 rpm) (若不分层则振荡混合后于沸水加热 3 分钟再离心 一次) 。 10.1.12. 取出下层液(水层)准备进行测试(一个检测需 0.1mL)。 稀释倍数: 4 10.2. 酶联免疫测定 使用前将试剂盒置于室温 (20-25℃) 平衡 30min 以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中, 将不用的微孔条放入自封袋, 保存于 2-8℃不要冷冻; 10.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入 100μ L 标准溶液。 10.2.2. 在其他的微孔加入 100μ L 已完成前处理的样品溶液。 10.2.3. 再于每一微孔另加入 500μ L 已完全回温的酶标记物。 10.2.4. 轻敲酶标板四周,使其充分混合后于室温下避光静置 30 分钟。 10.2.5. 将微孔中的反应液甩掉,再将清洗液加满每一微孔后甩掉,重复 3 次。 10.2.6. 最后一次甩掉后,在吸水纸上拍干。 10.2.7. 于每一微孔加入显色液 100μ L 后,轻敲酶标板四周,使其充分混合。 10.2.8. 于室温下避光静置 20 分钟。 10.2.9. 加入反应终止液,每一微孔加入 100μ L。 10.2.10. 酶标仪以单波长 450nm 或双波长 450nm/650nm 读值。 11. 呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测 11.1. 样本处理 11.1.1. 取 1 g 已均质样品置入离心管中,加入 4mL H2O,0.5mL 1 M HCl,100μ L 衍生试剂。 11.1.2. 振荡混合约 1 分钟。 作业指导书 文件编号: 第5页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 11.1.3. 置 60℃烘箱,静置 3h。 11.1.4. 加入 5 mL1×浓缩缓冲液,0.4mL 1M NaOH,5mL 乙酸乙酯。 11.1.5. 振荡混合约 1 分钟。 11.1.6. 以离心机离心 10 分钟(3000 rpm) 。 11.1.7. 取 2mL 上层液(乙酸乙酯层)至 10 ml 玻璃试管。 11.1.8. 于 50℃下,利用氮气将乙酸乙酯吹干(样品快速浓缩系统)。 11.1.9. 在此玻璃试管中加入 1mL 正己烷,先将残余物完全溶解(若未能完全溶解,可能会导致 回收率降低) ,再加入 0.8mL1×萃取/清洗液。 11.1.10. 振荡混合约 1 分钟。 11.1.11. 用离心机离心 10 分钟(3000 rpm) (若不分层则振荡混合后于沸水加热 3 分钟再离心 一次) 。 11.1.12. 取出下层液(水层)准备进行测试(一个检测需 0.05mL)。 稀释倍数: 2 11.2. 酶联免疫测定 使用前将试剂盒置于室温 (20-25℃) 平衡 30min 以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中, 将不用的微孔条放入自封袋, 保存于 2-8℃不要冷冻; 11.2.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别加入 100μ L 标准溶液。 11.2.2. 在其他的微孔加入 100μ L 已完成前处理的样品溶液。 11.2.3. 再于每一微孔另加入 50μ L 已完全回温的酶标记物。 11.2.4. 轻敲酶标板四周,使其充分混合后于室温下避光静置 30 分钟。 11.2.5. 将微孔中的反应液甩掉,再将清洗液加满每一微孔后甩掉,重复 3 次。 11.2.6. 最后一次甩掉后,在吸水纸上拍干。 11.2.7. 于每一微孔加入显色液 100μ L 后,轻敲酶标板四周,使其充分混合。 11.2.8. 于室温下避光静置 20 分钟。 11.2.9. 加入反应终止液,每一微孔加入 100μ L。 11.2.10. 酶标仪以单波长 450nm 或双波长 450nm/650nm 读值。 12. 结果判定 12.1. 定性判定 用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含硝基呋喃浓度范围 (ng/ml)。假设样 品 1 的吸光度值为 0.313,样品 2 的吸光度值为 1.032,标准液吸光度值分别是:0ppb 为 1.892; 0.025ppb 为 1.501;0.05ppb 为 1.175;0.1ppb 为 0.751;0.3ppb 为 0.421;0.6ppb 为 0.198。 则样品 1 的浓度范围 0.3ppb-0.6ppb;样品 2 的浓度范围 0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍 数) 作业指导书 文件编号: 第6页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 12.2. 定量判定 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0 标准)的吸光度 值(BO)再乘以 100%,即百分吸光度值。 百分吸光度值 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。 BO—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值。 以标准品百分吸光率为纵坐标,以硝基呋喃标准品浓度 (ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标 准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其 对应的稀释倍数即为样本中硝基呋喃的实际浓度。 若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样品的准确、快速分析。 13. 检测限、回收率和精密度 13.1. 检测限 AOZ 和 AMOZ 的检测限为 0.1ppb;SEM 的检测限为 0.2ppb;AHD 的检测限为 0.1ppb。 13.2. 回收率 AOZ: 80%~120%; AMOZ: 75%~115%; SEM: 80%~120%; AHD: 70%~130%; 13.3. 精密度 本方法的变异系数均小于 l0%。 13.4. 确证试验 如被测样品中硝基呋喃代谢物残留量的值大于检测限时,应用仪器方法进行确证。 14. 相关文件 呋喃唑酮(AOZ)酶联免疫检测试剂盒说明书(广州瑞森生物科技有限公司) 呋喃它酮(AMOZ)酶联免疫检测试剂盒说明书(广州瑞森生物科技有限公司) 呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测试剂盒说明书(广州瑞森生物科技有限公司) 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测试剂盒说明书(广州瑞森生物科技有限公司) 天平称量操作规程 高速离心机操作规程 氮吹仪操作规程 数显鼓风干燥箱操作规程 全自动洗板机操作规程 酶标仪操作规程 作业指导书 文件编号: 第7页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 15. 注意事项 15.1. 呋喃唑酮(AOZ)、呋喃它酮(AMOZ)、呋喃妥因(AHD)酶联免疫检测: (1) 将标准品 6 瓶、待测样品、10 倍浓缩萃取/清洗液、10 倍浓缩缓冲液、衍生试剂、浓缩酶 标记物、酶标板、显色液、反应终止液,置于室温下,回温 30 分钟。 (2) 1×缓冲液配制 用蒸馏水将 10 倍浓缩缓冲液以 1:9 的比例稀释(即 50mL 浓缩液+450mL 蒸馏水) ,即可作 为萃取步骤中『调控 pH』使用。1×缓冲液一旦配制完成,请放置于 2~8℃贮存(注:10 倍浓缩缓冲液请确实回温后使用,并请检查溶液底部的结晶是否完全溶解。 ) (3) 1×萃取/清洗液配制 用蒸馏水将 10 倍浓缩萃取/清洗液以 1:9 的比例稀释(即 50mL 浓缩液+450mL 蒸馏水) ,即 可作为样品萃取回溶,浓缩酶标记物稀释与微孔清洗使用。1×萃取/清洗液一旦配制完成, 请放置于 2~8℃贮存(注:10 倍浓缩萃取/清洗液请确实回温后使用,并请检查溶液底部 之结晶是否完全溶解。 ) (4) 衍生试剂乃配制于 DMSO 中,2~8℃保存会有结冰现象,若提供微温(30℃)的水浴将有 助于加速溶解。此外,为避免 DMSO 挥发造成操作者不适,请于抽风柜内添加此试剂。 (5) 1×酶标记物配制 用 1×萃取/清洗液将 400 倍浓缩的酶标记物以 1:400 之比例稀释(即 30μ L 浓缩酶标记 物+12mL1×萃取/清洗液) ,即为 1×的酶标记物(注:1×的酶标记物请于每次使用前新鲜 配制,未使用完的请丢弃) 。 (6) 用剩余的测试条孔则放回铝箔袋,将封口封好后储存于 2~8℃冰箱。 15.2. 呋喃西林代谢物(SEM)酶联免疫检测: (1) 使用前请先将试剂盒回温至室温(置于室温 60 分钟以上),各溶液皆摇匀后方可使用。 (2) 回温后,取出所需酶标板条,将剩余未测的 ELISA 孔条立即放回铝箔袋中,置于 4℃保存。 (3) 10 倍萃取稀释液与 10 倍清洗液请用蒸馏水稀释 10 倍方可使用。 (如 1mL 浓缩稀释液加 9mL 蒸馏水)稀释后的 1×萃取稀释液和 1×清洗液可于 4℃保存一周。 (4) 1×酶结合物稀释液配制: 利用蒸馏水将 5 倍浓缩酶结合物稀释液以 1:4 的比例稀释(即 1.5mL 浓缩液+6mL 蒸馏水) , 即可作为 1×浓缩酶结合物稀释使用。1×酶结合物稀释液一旦配制完成,请确实放置 2~8℃贮 存(注:5 倍酶结合物稀释液请确实回温后使用,并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。 ) (5) 1×SEM 酶结合物配制 利用 1×酶结合物稀释液将高倍浓缩的酶结合物以 1:100 的比例稀释(即 60μ L 浓缩 SEM 酶 结合物+6mL1×酶结合物稀释液) ,即为 1×的 SEM 酶结合物(注:1×的 SEM 酶结合物请于每次使 用前新鲜配制,未使用完的请丢弃) 。 (6) 萃取流程请使用 P.P.材质的 15mL 离心管以免腐蚀。 (7) 反应终止液含 0.5N HCl,请小心操作。 本试剂盒的所有试剂出厂前均做过完整的测试,请使用试剂盒提供的药品及试剂,勿任意更 换。 作业指导书 文件编号: 第8页 共8页 第 A 版 第 0 次修改 标 题:水产品中硝基呋喃的测定 颁布日期:2014 年 月 日 (8) ELISA 所得的 SEM 浓度若低于该样品检品敏感度即可视为该样品背景值,无须回乘稀释 倍数。反之若所得的 SEM 浓度若高于该样品检品敏感度,即可能为 SEM 阳性样品,建议使用再 其它检测方法检测,如 GC/MS 等。 (9) 衍生试剂乃配制于 DMSO 中,2~8℃保存会有结冰现象,若提供微温(30℃)的水浴将有 助于加速溶解。此外,为避免 DMSO 挥发造成操作者不适,请于抽风柜内添加此试剂。


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